Determinaçao indireta de glúten usando métodos baseados em ADN : PCR e genosensores eletroquímicos

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Farmacia, Sección Departamental de Química Analítica, leída el 15-10-2015.Depto. de Química en Ciencias FarmacéuticasFac. de FarmaciaTRUEunpu

Determinación indirecta de gluten mediante métodos basados en la detección de ADN: PCR y genosensores electroquímicos

La enfermedad celíaca es una enteropatía autoinmune muy frecuente (1% de la población) que se produce en individuos genéticamente predispuestos como resultado de una respuesta inmune exacerbada contra un factor ambiental bien definido, el gluten. De esta forma, es importante que los enfermos celíacos no consuman alimentos que contienen gluten. Además, parece que el consumo de cantidades relativamente pequeñas de gluten durante largos períodos de tiempo se correlaciona con un aumento del riesgo de desarrollo de complicaciones de tipo autoinmune.Por lo tanto, la identificación de la presencia de gluten y su cuantificación en productos alimenticios son de primordial importancia, a la vez que un reto para los científicos, debido a la dificultad de su análisis. Hoy en día, la verificación analítica del cumplimiento de los requisitos de etiquetado y de detección de trigo en los productos alimenticios se realiza principalmente por métodos que detectan proteínas tipo inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). Sin embargo, a pesar de los enormes avances en la detección de proteínas de gluten, algunas de las limitaciones de los métodos existentes han fomentado el desarrollo de tecnologías alternativas. Así, los métodos basados en el ADN, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR en tiempo real o los sensores de ADN (también denominados genosensores), representan opciones atractivas. Todos ellos comparten una ventaja significativa: el analito en sí se puede amplificar y, por lo tanto, se pueden detectar cantidades extremadamente bajas del mismo. También la mayor estabilidad de las moléculas de ADN, en comparación con las proteínas, los hace métodos muy convenientes, especialmente para su aplicación al análisis de alimentos procesados. Sin embargo, la enorme complejidad del genoma del trigo (probablemente el más complejo de las especies vegetales domesticadas), junto con su gran variabilidad genética lo convierten en una tarea desafiante a la vez que de enorme interés. En general, los métodos basados en la detección de ADN se utilizan principalmente como herramientas de cribado para detectar la presencia de alimentos alergénicos, pero la PCR y los genosensores ofrecen una alternativa de alta sensibilidad y especificidad frente a los métodos ELISA, también con fines de cuantificación. Además, los métodos ELISA y PCR analizan diferentes tipos de analitos, de modo que un resultado positivo en ambos ensayos representa una evidencia casi absoluta de que el alérgeno está presente.Debido a las ventajas de los métodos de ADN para la detección de trigo en alimentos, en la última década han surgido varios métodos de PCR y PCR en tiempo real, aunque la mayoría no alcanzan la sensibilidad necesaria. Una alternativa más sencilla y económica la constituyen los biosensores. Además de los métodos de PCR, los genosensores o sensores de ADN, en especial los genosensores electroquímicos, son una alternativa en la detección de ADN por su relativa simplicidad, bajo coste de la instrumentación, la posibilidad del análisis en línea, o diseño de equipos miniaturizados y portátiles. Sin embargo su aplicación para la detección de trigo en alimentos está sin explotar. La Tesis Doctoral se centra en la detección indirecta de gluten empleando secuencias de ADN específicas de cereales dañinos para enfermos celiacos, como alternativa a los métodos de detección de proteínas. Se realizó una búsqueda de las secuencias de ADN relacionadas con los cereales tóxicos para los enfermos celíacos adecuadas para emplearlas como analito. Se caracterizó ampliamente el comportamiento de tres secuencias de ADN por PCR en tiempo real y se evaluaron críticamente, obteniéndose con todas ellas una sensibilidad notablemente superior a la mencionada en la literatura hasta el momento (<20 ppm), cumpliendo con los requisitos impuestos por la legislación vigente. Se constató una fuerte influencia de la matriz en los resultados obtenidos, siendo las matrices de arroz y maíz las que ofrecieron las mejores prestaciones analíticas. Este hallazgo apunta a la necesidad de adecuar la matriz de los patrones a la de la muestra para evitar desviaciones negativas o positivas del valor verdadero. La secuencia de oligonucleótidos que codifica el péptido inmunodominante de la gliadina fue la que suministró los mejores resultados, motivo por el cual se diseñó un genosensor electroquímico para su detección, el primero específicamente diseñado para el análisis de gluten. Al contrario que para el caso de otros genosensores electroquímicos, la detección de fragmentos amplificados por PCR de muestras reales se pudo realizar sin ningún tipo de purificación previa de los amplicones y permitió cuantificar 15 pg de ADN de trigo o 0.001% de trigo en matriz de arroz, una detectabilidad que rivaliza directamente con los métodos más sensibles de PCR en tiempo real. El genosensor permitió la determinación de ADN de todos los cereales tóxicos incluida la avena mientras que no mostró reactividad cruzada con otras especies seguras como arroz y soja. Para disponer de un método específico de trigo, la selectividad del sensor fue modificada mediante el uso de sondas estructuradas que permitieron la detección selectiva de trigo frente a otros cereales filogenéticamente relacionados (cebada, centeno, avena) sin comprometer en gran medida las características analíticas del genosensor diseñado. Por último se exploró el método de análisis de curvas de disociación de alta resolución (HRM de sus siglas en inglés, high resolution melting) para su aplicación en la identificación de cereales tóxicos, pudiéndose discriminar el tipo de cereal del que proviene el gluten presente en una muestra. En definitiva, los métodos propuestos en este trabajo, una vez caracterizados y optimizados, suponen un avance en la detección de gluten a través de secuencias de ADN específicas de trigo y constituyen sistemas pioneros en un campo que está aún por explorar, pero que tiene enormes posibilidades de desarrollo

Adaptation and Measurement Invariance by Gender of the Flourishing Scale in a Colombian Sample

There is increasing interest in the study of flourishing as an indicator of subjective wellbeing. The objective herein was to adapt and study the psychometric properties of Diener's Flourishing Scale (FS) among the Colombian population. Accordingly, a cross-sectional study was conducted with a non-probability sample of 1255 Colombian adults. The scale's structure, invariance by gender, and convergent and concurrent validity were studied from a confirmatory perspective using structural equation models. The confirmatory factor analysis showed excellent fit indicators for the one-dimensional structure (CFI = 0.985, RMSEA = 0.039, SRMR = 0.020) as well as for the convergent (CFI = 0.909, RMSEA = 0.050, SRMR = 0.063) and concurrent (CFI = 0.966, RMSEA = 0.036, SRMR = 0.041) validity models. The correlations calculated among flourishing with positive and negative effects (PANAS), satisfaction with life (SWL), and optimism and pessimism (LOT) were statistically significant and as expected. Configural, metric, and scalar invariance across gender was confirmed. Percentiles were provided for the total score. The FS scale was a valid and reliable measure to assess high levels of wellbeing among the Colombian population

Hand Rehabilitation after Chronic Brain Damage: Effectiveness, Usability and Acceptance of Technological Devices: A Pilot Study

Purpose: The aim is to present an overview of existing tools for hand rehabilitation after brain injury and a pilot study to test HandTutor® in patients with chronic brain damage (CBD)

Adaptation and Psychometric Properties of the Scale of Positive and Negative Experience (SPANE) in the General Colombian Population

(1) Background: Diener's Scale of Positive and Negative Experiences (SPANE) assesses the presence and intensity of positive and negative affects, since these are considered basic aspects of the study of well-being. This article studies its psychometric properties in the general Colombian population. (2) We conducted a cross-sectional study of a sample of 1255 Colombians and we used structural equation modeling to confirm the bifactor structure. Additionally, we studied invariance by gender, and convergent and concurrent validity. (3) We found acceptable fit indicators for the bifactor model (CFI = 0.889, RMSEA = 0.046, SRMR = 0.059) as well as for the convergent (CFI = 0.909, RMSEA = 0.050, SRMR = 0.063) and concurrent (CFI = 0.966, RMSEA = 0.036, SRMR = 0.041) validity models. We did not confirm total invariance across gender, although we found configural and metric invariance, so percentiles by sex were provided. (4) Conclusions: The SPANE is a valid and reliable measure to assess well-being among the Colombian population, although we alert researchers to the risk of comparing affectivity average scores between sexes

Evidence of validity and measurement invariance by gender of the Vaccination Attitudes Examination (VAX) scale in Colombian university students

Background: Having a valid tool to assess attitudes toward vaccination and identify the concerns that drive vaccine refusal can facilitate population studies and help guide public health interventions. The objective of this study has been to adapt the Vaccination Attitudes Examination (VAX) scale in Colombian university students and to study its psychometric properties in a non-probabilistic sample of 1074 Colombian university students. Methods: A confirmatory factor analysis was used to study the factorial structure. A structural equation model was tested to study concurrent validity and to check whether the factors predicted having received the coronavirus vaccine. Gender-based measurement invariance was also studied for the best model. Results: The results support the structure of four related factors. The composite reliability index was good for all the factors, but the average variance extracted was not as good for the second factor. There was strong measurement invariance by gender, and two factors are good predictors of being vaccinated or not. Conclusions: The VAX has shown construct and concurrent validity and is a reliable tool for evaluating attitudes towards vaccines in university students in Colombia. It may help guide the implementation of actions for the National Vaccination Plan and institutional policies

Data on recovery of 21 amino acids, 9 biogenic amines and ammonium ions after spiking four different beers with five concentrations of these analytes

A novel chromatographic method for the simultaneous analysis of nine biogenic amines, 21 amino acids and ammonium ions in beer has been recently described in “A UHPLC method for the simultaneous analysis of biogenic amines, amino acids and ammonium ions in beer” (Redruello et al., 2017) [1]. The present article provides recovery data of the 31 analytes after spiking four different beers with five concentrations of each analyte (15, 30, 60, 120 and 240 µM).This work was performed with the financial support of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (AGL2013-45431-R) and the Plan for Science, Technology and Innovation 2013–2017 of the Principality of Asturias, which is co-funded by the European Regional Development Fund (GRUPIN14-137).Peer reviewe

A Trypanosoma cruzi Genome Tandem Repetitive Satellite DNA Sequence as a Molecular Marker for a LAMP Assay for Diagnosing Chagas' Disease

Chagas' disease is a neglected tropical disease caused by Trypanosoma cruzi which is endemic throughout Latin America and is spread by worldwide migration. Diagnosis is currently limited to serological and molecular techniques having variations regarding their sensitivity and specificity. This work was aimed at developing a new sensitive, applicable, and cost-effective molecular diagnosis technique for loop-mediated isothermal amplification-based detection of T. cruzi (Tc-LAMP). The results led to determining a highly homologous satellite repeat region (231 bp) among parasite strains as a molecular marker for diagnosing the disease. Tc-LAMP was performed correctly for detecting parasite DNA (5 fg for the CL Brener strain and 50 fg for the DM28, TcVI, and TcI strains). Assay results proved negative for DNA from 16 helminth species and 7 protozoa, including Leishmania spp. Tc-LAMP based on the highly repeated T. cruzi satellite region is thus proposed as an important alternative for diagnosing T. cruzi infection, overcoming other methods' limitations such as their analytic capability, speed, and requiring specialized equipment or highly trained personnel. Tc-LAMP could be easily adapted for point-of-care testing in areas having limited resources